AUICEM 2012

Mecanisme moleculare in sepsisul sever: abordare din prisma epigeneticului
W.F. Carson, S.L. Kunekel
Pg 3-11

Sepsisul sever, socul septic, arsurile, stroke-ul si leziunea de ischemie re-perfuzie au in comun anumite mecanisme fiziopatologice. In ciuda diferitelor lor etiologii au multe similaritati din punctul de vedere al evolutiei imunologice.
Supravietuitorii unui soc sever traiesc semnificativ mai putin dencit populatia generala. Reducerea duratei de supravietuire coreleaza cu susceptibilitate crescuta la infectii nosocomiale si infectii oportunistice.
Supravietuitorii unui soc sever si cei ai traumatismelor prezinta adesea fenotipuri imunosupresoare particulare care implica atit sitemele de celulele implicate in procesul imun cit si functiile lor. Aceste fenotipuri au fost identificate atit la om cit si la animale. Sepsisul sever si infalmatia se asociaza adesea cu apoptoza masiva la numeroase nivele dintre care apoptoza celulelor imune este cruciala; fenomenele imunologice observate dupa aceea sint adesea asociate cu acesata pierdere masiva de celule imunitare. Totusi, resectiva deficienta definita adesea drept imunosupresie post-septica persista adesea in ciuda eventualei reveniri a numarului de celule imunitare (atit in singele periferic cit si in organele limfatice) la nivelul anterior agresiunii.
Scopul principal al cercetarilor contemporane in imunosupresia indusa de sepsis si cea indusa de socul sever este acela de a elucida mecanismele moleculare care stau la baza fenomenului de imunosupresie persistenta IN celulele care au supravietuit sepsusului sever si si-au revenit dupa evenimentul apoptotic.
Implicatiile clinice sint evidente.
In sepsisul sever continua sa existe putine posibilitati de diagnosticare a imunosupresiei. Singura modalitate disponibila este analiza functionala a leucocitelor (functional analysis of leukocyte function). Legatura dintre inflamatia severea si imunodepresie ramine o cutie neagra care trebuie descifrata la nivel molecular. Este o sarcina importanta aceea de a se identifica un tratament pentru imunosupresia post-septica .Din cealalta perspectiva, folosirea imunosupresoarelor pentru tratamentul unor boli cornice pot duce la reducerea supravietuirii in acut prin modularea neadecvata a functiei imunitare.
Un ultim scop al actualei prezentari este acela de a identifica legaturi intre stresul fiziologic al raspunsului fazei acute si evolutia imunologica pe termen lung a pacientului care supravietuieste unui episod inflamator amenintator de viata.
Date recente din domeniul epigenetic au furnizat citeva informatii despre conexiunile dintre infalmatia severa, reglarea functiei genice si functia celulelor imune.
Epigenetica este un cimp larg de studiu care circumscrie toate mecanismele celulare implicate in reglarea functiilor genelor fara sa se modifice structura acestora.
Exemple de mecanisme epigenetice

– modularea fucntiei genei (de tip silencing) prin metilarea AND
– modularea expresiei genice prin modificarea histonelor
– modularea fucntei genelor prin modificari postranscriptionale la nivelul mRNA prin expresia mcro-RNA.

Epigenetica joaca un rol fundamental in biologie mai ales in controlul diferentierii celulare de la progenitorii multipotenti la celulele mature specializate.
Epigenetica controleaza

– hematopoeza
– activarea si lineage commitment (filiatie angajata, maturare ?) a leucocitelor adulte

Raspunsul imun productiv necesita insumarea tuturor celor trei mecanisme epigenetice pentru a conduce functia genica. Un coroloar al acestei afirmatii este acela ca daca ne aflam in fata unui control incorect al activitatii genice raspunsul imun va fi neadecvat. Modularea raspunsului genic prin mecanism epigenetic la nivelul celulelor imune a fost pus in legatura cu unele boli

– boli autoimmune
– imunosupresie

Epigenetica joaca un rol din ce in ce mai mare in intelegerea fiziopatologiei sepsisului, socului, traumatismelor dar si a imunosupresiei post-septice.

a. Mecanismele epigenetice controleaza functia leucocitara in post-sepsis

In ciuda acumularii importante de date si posibilitati terapeutice in domeniul sepsisului mortalitatea continua sa fie mare. (nn Date statistice din 2011 vorbesc despre mortalitate de cel putin 35% in sepsiul grav si socul septic in tarile dezvoltate. In tarile nedezvoltate mortalitatea ramine la cel putin 50%). Ea se explica prin complexitatea acestei stari care implica

– furtuna citokinica care este un complex dificil de inteles de molecule intredependente
– disfunctia multipla de organ
– distructii tisulare multiple

Sint implicate toate componentele sistemului imun atit componenta celulara cit si cea umorala dar si cea innascuta si cea dobindita. Exista o multitudine de stimuli care influenteaza activarea si functionarea fiecarui subset de celule immune. Din cauza coplexitatii procesului, adesea terapiile care au ca tinta mediatorii proinflamatori esueaza in a controla raspunsul inflamator in sepsis. Un exemplu important este folosirea de anticorpi anti alfaTNF in acest scop. Desi alfaTNF joaca un rol crucial in furtuna citokinica blocarea lui prin anticorpi specifici nu a fost urmata de imbunatatirea evolutiei pacientului septic cu exceptia situatie particulare in care se bloarea alfaTNF se realizeaza intr-un interval foarte limitat si precis de evolutie a sepsisului. Rezultatele aceste aduc in atentia noastra multifactorialitatea raspunsului septic dar si necesitatea de a ne adresa, pe de-o parte unor multiple tinte alese dintre medaitorii proinflamatori si pe de alta parte obligativitatea ca interventia sa se realizeze in fereastra de timp adecvata.
Pentru depasirea SIRS sistemul imun al pacientului trebuie sa controleze expresia unor numerosi mediatori pro-inflamatori la nivelul mai multor tipuri de celule.
Multe dintre mecanismele moleculare care care controleaza trecerea de la SIRS la CARS (compensatory anti-inflammatory response syndrome) sint cu spectru larg cum ar fi:

– cresterea globala a citokinelor antiinflamatorii ca IL-10 si TGF beta
– cresterea citokinelor care guverneaza calea Th2 ca IL-3 si care contracareaza raspunsul Th-1

Aceste doua mecanisme nu reduc activ supra-expresia continua a citokinelor pro-inflamatorii. Ele se adreseaza suprimarii functiei inflmatorii a celuleor implicate atit la nivelul mecanismelor imune innascute cit si la nivelul celor dobindite.
Identificarea mecanismelor epigenetice endogene care duc la fenomenul de “gene silencing” pot permite identificarea unor tinte terapeutice moleculare interesante.
Identificarea markerilor asociati cu dezvoltarea CARS si imunosupresia post-septica va permite identificarea pacientilor care sint la risc de a dezvolta un sepsis sever sau un soc septic.

Markeri CARS si imunosupresie post-septica

– reducerea activitatii potentiale a celulelor mieloide si limfoide ca raspuns la al doilea stimul (cum ar fi liganzii TLR sau Ag) in contextual complexului MHC.

Ea se evidentiaza prin reducerea producerii de cytokine proinflamtorii la cea de-a doua stimulare.
La nivelul celulelor dendritice scade productia de IL-12 dupa sepsis. Acest deficit se traduce prin reducerea rezistentei la infectarea cu germeni oportunisti cum este Asperillus fumigatus.
Macrofagele prosuc mai putine IL-12 si alfa-TNF.
La nivelul celulelor CD4+T se observa o dereglare a generarii de cytokine prin liniile Th atit in vitro cit si in vivo. Se identifica si o modificare a fenotipului citokinic al Th-1 si Th-2 precum si o tendinta crescuta a celulelor naïve efectoare DC4-T sa devinta T reglatoare.
Concomitent au fost identificate mecanisme epigenetice precise care se mentin la distanta de evenimentul declansator.
Studiile sint executate in vitro.

Celulele macrofage

– studiile s-au realizat mai ales cu LPZ urmarindu-se toleranta la acestea

S-a observat ca la a doua expunere la LPZ a macrofagelor acestea devin refractare desi la prima expunere raspunsul secretor a fost adecvat. In acest caz s-au identificat urmatoarele modificari epigeneice:

– cresterea nivelului de metilare represiva H3K9 in regiunile promoter Il 1b si Tnfn care are ca rezultat reducerea producerii de IL 1beta si alfa-TNF.

– Pe regiunea promoter Tnfa actioneaza doua enzyme (histonmetil transferaza G9a si ADNmetil transferaza Dnm+3a1b). Ele sint implicate in realizarea tolerantei la LPZ

Studiile de mai sus au fost realizate in vitro.
Studii in vivo au urmarit nivelul de exprimare al macrofagelor pulmonare pentru acetilarea (H4) si metilarea (H3K4) histonelor in regiunile promoter (Il 12p35 si Nos 2) pentru sinteza de alfaTNF.
Se presupune ca mecanismele descrise mai sus sint importante pentru imunospuresia post-septica.

Celuele dendritice din linia mieloida

Ele au fenotip citokinic asemanator magrofagelor.
Iai reduce productia de Il-12 sub stimularea TLR si cu implicarea Th1 si CD4+T ca urmare a modularii histonelor (H3K4me, H3K27me) la nivelul promotorilor Il2p35 si Il12p40

Celulele CD4+T

Socul septic este considerat un sindrom imun interesind mai ales sistemul imun innascut declansat pe calea de semnalizare a TLR la expunerea la germeni patogeni si produsi microbieni care necesita sau nu prezenta celule necrozate.
SIRS si CARS implica mai ales sistemul imun adaptativ.
Ex. Sistemul celulelor T produc IL-2, IFNgamma si IL-17A. Ele joaca un rol important in furtnuna citokinica prin favorizarea proliferarii leucocitare, activarea liniei Th-1, generarea sau acumularea de neutrofile.
Switcu-ul SIRS – CARS coreleaza cu cresterea citokinelor generate tot de celule T (IL-10, IL-4). Ambele suprima sau modifica raspunsul Th1 central la sepsis.
De asemenea, switch-ul SIRS – CARS coreleaza cu o crestere a celulelor T periferice reglatoare si poate functiona ca sabie cu doua taisuri. Celulele T reglatoare pot suprima inflamatia nedorita din SIRS dar lasa gazda vulnerabila la infectii secundare.
Sitemul imun adapataiv este foarte important pentru apararea fata de o mare varietate degermani patogeni dar modularea lui este generatoare de imunosupresie.
Deficeinte ale fucntiei celulelor CD4+T dupa sepsis rezulta din reducerea raspunsului proliferativ, modularea producerii de citokine, cresterea apoptozei in tesutul limfoid. Exista studii care asociaza modularea in modificarea histonelor cu deficientele de activare de mai sus si furnizeaza un mecanism molecular pentru filiatia atribuita a limfocitelor Thelper (Th lineage commitment).
Dupa inceperea sepsisului, in timpul trecerii de la SIRS la CARS celulele CD4+T prezinta un raspuns citokinic inhibat pentru Th1 in loc de Th2. Acest fenomen poate fi atribuit partial reducerii producerii de IL-12 de catre celulele dendritice post-septice. Totusi, acest comportament se mentine chiar dupa restimularea in vitro a celulelor in absenta unor celule accesorii. Ceea ce-i face pe cercetatori sa se orienteze catre un mecnism inhibitor intrinsec care duce la inhibarea generari raspunsului Th1. Celulele CD4+T de la animalele post-septice prezinta o crestere a metilarii represive de la nivelul H3K27 a promotorului Ijng care este o gena critica pentru functionarea Th1. Ca urmare scade productia de INFgamma in populatia de celule CD4+T care pot fi ininfluentate pe filiera Th1. Se ajunge in acest fel la modificari de lunga durata ale activitatii celulelor CD4+T post-septice. Autorii dau ca exemplu cresterea metilarii H3K27 in regiunea promoter Gata3 (care este un factor de transport important in Th2) care coreleaza cu un ”lineage commitment” incomplete la Th2. Cresterea metilarii H3K9 in regiunea promoter Foxp3 (un factor reglator al trasncriptiei in celulele T) coreleaza cu cresterea numarului de ceule T reglatore si cresterea activitatii acestora in celulele CD4+T post-septice.
In ambele cazuri se ajunge la modificri importante ale functiei CD4+T.

In concluzie
Este limpede ca situatii cu raspuns inflamator sever, amenintatoare de viata, pot avea efecte semnificative si de lunga durata asupra raspunsului imun. Un rol important il au celulele mieloide si limfoide prin supresia producerii de citokine si modularea a ceea ce se numeste ”linage commitment decisions”. Cunostintele in domeniu continua sa fie insuficiente.
Ex. Depsre cum se modifica in “+” sau “–“ activitatea enzimelor care modifica histonele se stie putin ca despre fenoemnul epigenetic in totalitate.

b. Enzimele care modifica histonele in sepsis: reglarea functiei laucocitelor si gravitatea bolilor.

Se crede ca expresia si sau activarea enzimelor care modifica histonele pot fi afectate de inflamatia sistemica. De asemenea este posibil ca enzimele acestea sa joace un rol important in declansarea si desfasurarea furtunii citokinice prin activarea locilor proinflamtori.
Mecanismele sint greu de investigat din cauza conplexitatii fenomenelor si a lipsei animalelor modificate in acest sens. De asemnea, moleculele disponibilie nu au efecte tintite pe fenomenele de interes.
Studii recente au arata totusi ca sepsieul si functia imuna celulara asociata sepsisului por fi modificate prin modificarea (modularea) activitarii enzimelor care modifica histonele.
Histonele pot suferi fenomene de metilare, acetilare, fosforilare…etc.
S-a lucrat pe enzime de tip deacetilaza (HDACs = histone deacetylase enzymes) si inhibitori ai acestora (HDACIs = histone deacetylase inhibotors).
Pe singe uman s-a folosit calsa de inhibitori de mai sus si s-a obtinut blocarea sau reducerea producerii de citokina dupa stimularea cu LPZ.
Pe modele experimentale in vivo s-a obtinut:

– reducerea markerilor de sepsis (infiltrat celular, nivelul seric de citokine )
– reducerea grabitatii sepsisului tradusa prin rducerea mortalitatii.

Studiul metilarii histonelor se confrunta cu lipsa agentilor active in acest sens. Totusi, a fost creat un model de soarece modificat genetic in acest sens pe care se lucreaza.

Concluzii

Sepsisul grav si socul septic se caracterizeaza prin supa-producerea necontrolata de chemokine si citokine proinflamatorii care duc la generarea unui raspuns inflamator sistemic, care, la rindul sau este urmat de leziuni celulare si crestera mortalitatii.
Mecanismele epigenetice de control al activitagii genice joaca un rol fundamental in generarea raspunsului septic. Studiul acestor fenomene complexe este la inceput. Este posibil ca intelegerea fenomenului sa aduca in atentia noastra noi tinte terapeutice. Numai sa nu se intimple la fel cum s-a intimplat cu descifrarea functiei TLRs a caror manipulare nu a pemis, inca, imbunatatirea ingrijirii pacientului septic.

Imi permit sa fixez o amintire recenta si niste observatii.
La deschiderea congresului din primavara aceasta de la Bruxeles, linga mine s-au asezat doi mai tineri colegi de specialitate.
Tinindu-se seama de importanta care se acorda in acest moment intelegerii fenomenului epigenetic, una dintre cele patru prezentari din ceremonia de deschidere s-a referit la metilarea histonelor si importanta lor in controlul activitatii genice. Stimatii mei colegi au suportat prlegerea pina pe la mijolc, dupa care s-au declarat nemultumiti: Treaba asta cu metilare nu o mai suport, a zis domnisoara si s-a ridicat sa pleca insotita de tinarul sau companion. Si au plecat.
La fel am patit-o mai tirziu cu o alta colega care era foc de suparata pe cleulel dendritice, acelea care au rol fundamenatal in decalnsareaa sepsisului, intretinerea lui si depresia imuna post-septica.
Din nefericire, ceea ce nu intelegem, ignoram si ne intoarcem la lucrurile cunoscute noua carora le acordam o mult mai mare importanta decit merita. Si tot din nefericire, atunci cind evenimentele nu se desfasaora asa cum ne asteptem, nu ne intoarcem la ceea ce nu stim ca sa incercam sa intelegem ci dam cele mai fantasmagorice explicatii folosindu-ne de ceea ce stim.
Si aici remeorez momentul in care s-a nascut imunitatea ca stiinta si absurditatea primei teorii in domeniu.
In laboratorul lui Pasteur, lucra un umil cercetator, pe numele sau Roux (daca nu ma insel). Se lucra la studiul unui germene cu care erau infectate niste gaini. La un moment dat, un lot de gaini desi corect injectate de respectivul cercetator nu au facut boala. Nefacind boala, Roux le-a lasat printre gainile sanatoase. La o a doua testare, printre gainile ijectate s-au numarat si citeva dintre gainile din lotul cu pricina. Toate animalele de expetienta au facut boala, mai putin acestea. De data aceasta, Pasteur a sesizat fenomenul iar Roux si-a adus aminte de evenimente privind cu groaza la maestru… si asteptind un perdaf pe masura. Mastrul nu numai ca nu l-a certat, l-a lasat in boii lui si s-a retras singur citeva zile perioada in care nu a vorbit cu nimeni. Dupa ragazul de meditatie a iesit cu prima teorie care incerca sa explice mecanismele imunitatii prin aberanta ipoteza a consumului de substrat. Prima injectare care nu a reusit sa produca boala a dus la consumul substratului necesar dezvoltarii germenilor ceea ce a facut ca la o a doua injectare acestia sa nu mai aiba pe ce sa se dezvolte…
Asa s-a nascut imunoloigia si ipoteza gresita a consumului de substrat a stat la baza producerii primelor vaccinuri si folosiea lor in practica.
Pasteur a fost un gigant al gindirii biologice, in ciuda pregatirii sale de chimist, pe cind Roux n-a fost decit un modest lucrator in domeniul biologiei care nu s-a remarcat prin aproape nimic si care nu s-a putut molipsi de la genialitatea mentorului sau.
Ma tineri colgi si prieteni,
Nu ignorati marile descoperiri ale vremurilor voastre. Incercati sa le sesizati si sa le integrati in sistemul dumneavoastra de gindire medicala. Nu va limitati numai la protocoale. Protocoalele va apara de malpraxis-ul oficial si de avocati, dar nu va deschid perspective noi. Nu asteptati ca sefii specialitatilor dumneavoastra sa ajunga sa sesizeze importanta desoperirilor contemporane. Este posibil ca dinsii sa le vada mult prea tirziu. In acest moment informatia biologico-medicala la nivelul sau teoretic in cele mai multe dintre domeniile noastre este in urma cu cel putin 5-10 ani fata de starainatate.