AUICEM 2012

Metabolomics

Abordarea diagnosticului in ICU din punctul de vedere metabolomics
N.Nin, J.L. Izquierdo-Garcia, J.A Lorente

Introducere
Descifrarea genomului uman nu a adus atitea raspunsuri cite s-a sperat. Nu se stie inca, de ce in situatia unui anumit genom se manifesta un anumit raspuns genic si celular la un anumit tip de agresiune. Se spera ca studierea metabolm-ului sa furnizeze raspunsurile dorite.
Metabolom-ul este definit ca totalitatea metabolitilor finali si intermediari din bilologia unui organism. Metabolomics-ul poate fi definit ca studiul stintific al raspunsului metabolic al unui sistem viu la stimului fiziopatologici sau modificari genice.

Succesiunea AND – gene – mARN – proteine – metaboliti – fenotip este dublata de succesiunea genomics – transcriptomics – proteomics – metabolomics – fenotip.

Studiul intensiv al metabolomului a fost posibil prin dezvoltarea la inceputul anilor 79 a tehnicilor de separare prin cromatografie. A urmat dezvoltarea tehnicii de rezonanta magnetica de spin nuclear (1H-nuclear magnetic resonance) care a fost folosita pentru prima data in studii metabolice in 1977 cind o serie de compusi ca lactatul, creatinina, alanina… au fost identificati in suspensie de hematii.S-a putut, astfel, determina intrega complexitate a structurii chimice dintr-o proba biologica. La aceasta identificare s-a adaugat posibilitatea analizei statistice de tip multivarianta.

Tehnici analitice

1. MRS

MRS = NMR spectroscopy.
Este o tehnica nedestructiva care da informatii despre structura moleculelor si concentratia acestor molecule (concentratie relaticva sau absoluta).
NMR este un fenomen care consta din captarea si eliberarea de energie electormagnetica a unor nuclei plasati intr-un cimp magnetic.
MRS se bazeaza pe faptul ca izotopi aceluiasi compus NU rezoneaza la fel in acelasi cimp magnetic, diferenta venind din interactiunea cimpului magnetic nuclear cu cimpul generat de norul de elctroni care sint specifice fiecaruia izotop in parte.
Varianta HR-MAS (high resolution magic angle spinning) permite obtinerea de semnale de inalta rezolutie de la tesut intact cu preparare minima si identificarea moleculelor care intra in compozitia acestuia. Tehnica este cu mult mai putin sensibila decit spectometria de masa. Dezvoltarea recenta a prepararii prin inghetarea a probelor a permis o mai buna acuratete a semnalului prin limitarea artefactari datorata energiei termice continute de molecule.
MRS prin varianta sa HR-MAS este singura tehnica care permite studierea structurii moleculare a tesutului intact.
Variantele COSY (correaltion spectroscopy) si TOCSY (total correlation spectroscopy) dau informatii despre legaturile H-H iar alte variante pot da informatii despre legaturi C-H.

2. Spectroscopia de masa

Este o tehnica analitica destructiva mai sensibila decit cea anterioara.
Permite identificarea unor molecule aflate in concentratii reduse.
In general aceste tehnici se cupleaza cu altel cum ari fi cromatografia gazoasa (GC), cromatografia lichidiana (LC), electroforeza capilara (CE), mobilitatea ionica sau spectrosopia FTIR.
Cea mai frecventa asociere este MS cu cromatografie lichida LC-MS care include si HPLC (high pressure liquide cromatographie) si UHPLC (Ultrahigh pressure LC). LC-MS furnizeaza un grafic tridimensional cu molecule identificate.

Spectral data analysis

– 1.Procesarea datelor care are ca scop inlaturarea factorilor care port interfera cu analiza statistica ulterioara

Se refara la concentratii si variatii legate de diferenta dintre probe

– 2.Analiza statistica propriuzisa care consta dintr-o baterie de metode incluzind proiectii multivariante ca PCA (principal component analysis) si PLS-DA (parial least square descrinination analysis)
PCA este cea mai folosita tehnica exploratorie a analizei multivariante. Cu ajutorul ei se identifica grupuri de structuri moleculare din proba investigat.

PLS-DA este o regresie liniara care identifica zonele moleculare care descriu cel mai bine proba care ne intereseaza.

Analiza metabolomica in critical illness

Analiza H-MRS a lichidelor bilologice. In varianta sa HR-MAS este o alegere excelenta pentru studiul unor lichide neprocesate.
Starea critica este caracterizata printr-o alterare severa a homeostazei metabolice si alterare severa a cailor de semnalizare.
Studiul metabolitilor poate defini fenotipuri specifice ale diferitelor sindroame acute care pot permite intelegerea proceselor fiziopatologice, identificarea precoce a bolii, indetificarea pacientilor la risc, determina severitatea bolii, stabili prognoza evolutiei si raspunsul la terapie. In acest context metabolomics-ul poate schimba conceptul biomarkerilor.
Ex. ARDS, arsii sever la care s-ar putea identifica markeri metabolici specifici.

1. Sepsis
Soareci cu sepsis produs prin ligatura cecala si punctie (CLP) studiati cu HPLC-MS la care s-a construit un model prognostic. Metoda a permis sa se identifice soarecii care supravietuiesc cu acuratete de 94%.
Sase metaboliti au fost urmariti

– acidul linoleic
– acidul linolenic
– acidul oleic
– acidul stearic
– acidul decosahexaenoic
– acidul decosapentaenoic

Studiu cu H-MRS a identificat un set de alti sase metabolite cu acuratete de 87 in predictia mortalitatii

– lactate
– alanina
– acetate
– acetostearat
– hidroxibutirat
– format

Probe plasmatice de la soareci cu injurie termica si sepsis, metoda LC-MS a identificat alti noua metabolite

– hipoxantina
– indoxil sulfat
– acid glucuronic
– acid gluconic
– prolina
– uracil
– nitrotyrosina
– acid uric
– acidul trihidroxi colanoic

Soareci cu CLPsi metoda H-MRS aplicata pe tesut pulmonar, lavaj bronhoalveolar si ser au identificat concentratii caracteristice diferite de metabolite specifici fata de martori.
Tesutul pulmonar cresc concentratiile de

– alanina
– creatina
– fosfoetanolamina
– mioinozitol

BAL

– creste creatina
– sccade mioinozitolul

Ser

– cresc urmatorii produsi : alanina, creatina, fosfoetanolamina, acetoacetat si inca doi AG neidentificati
– scade formatul

Modelul construit cu toti acesti metabolite a putut preciza cu 100% rata de succes diagnosticul de sepsis

2. ALI/ARDS

Diagnosticul actual al acestei stari se face pe criterii nespecifice: clinice, fiziologice, radiologice.
Au fost propuse si alte criterii ca profilul genetic si o baterie de proteine serice care nu s-au artat suficient de sensibile.
Soareci, ALI / ARDS prin instilatie traheala de IL1-beta si TNFalfa, metoda H-MRS. S-au determinat pe fragmente de tesut pulmonar:

– metaboliti energetici : ATP, ADP, echilibrul energetic si schimburile energetice
– raportul lactat/glucoza

care s-au dovedit a fi markeri de suferinta pulmonara.
S-a stabilit si o corelatie in timp intre modificarile metabolice si indexul histologic de sufernita pulmonara.
Pacienti cu ALI de origine septica, probe sanguine, metoda H-MRS.
Au fost identificate diferente semnificative intre subiectii normali si cei din lotul de studi la nivel de

– glutation total
– mioinositol
– adenosina
– fosfatidilserina
– sfingomielina

Concentratiile de minoinositol si glutation au fost asociate cu modificarea parametrilor fiziologici ca : scorul acut fiziologic si zilele libere de ventilator.
VILI la soarece, H-MRS, tesut pulmonar si BAL. Valorile urmatorilor parametri au fost modificate semnificativ:

– lactat
– glucoza
– creatina
– glicina
– hidroxibutirat

Autorii acestui studiu considera ca tehnica este sensibila si utila pentru diagnosticare biotraumei la pacietnul ventilat mecanic.

3. AKI

Biomarkerii traditionali pentru AKI:

o urea sanguina
o creatinina sanguina

au sensibilitatea redusa in stadiile precoce de degradare a functiei renale.
Biomarkeri noi

o NGAL (neutrophile gelatinase associated lipocalin)
o IL-18

sint in studiu si par afi promitatori.
Nu exista studii in domeniul metabolic la AKI la om.
Experimental
Soarece, IRA indusa cu cisplatina , metada H-MRS a identificat

– urina : glucoza, alanina, lactat, leucina, metionina, 2-oxiglutarat, piruvat si valina
– ser, urina, tesut renal: crestere timp dependenta a concentratiei de acizi grasi neesterificati si trigliceride

Autorii sugereaza ca acest profil metabiloc poate fi utilizat penru identificarea precoce a AKI in clinica umana. Nu exista studii clinice care sa confirme ipoteza.

4. Trauma

Exista studii clinice.
Metoda H-MRS
Determinari de lactat seric care pot identifica pacientii care evolueaz catre MSOF (lactat crescut) si pe cei care nu vor evolua in acest sens.
Determinari de lipide serice: scaderea nivelelor a trei lipide este predictor bun de evolutie catre MOSD iar concentratiile plasmatice de glucoza si glutamat sint predictori intermediar.