AUICEM 2012

Metabolomics in critically ill patients, focalizare pe aerul expirat
LDJ Bos, PJ STERK, MJ Schultz

Introducere
Pacientul din ICU poate dezvolta precoce ALI/ARDS pentru care sa se instituie VM. VM aduce riscul de VAP (mecanism infectios) si VILI (barotrauma, volotrauma, biotrauma).

Diagnosticul ALI/ARDS criteriile de consens americane-europene:

o infiltrat pulmonar bilateral
o hipoxie

VAP este suspicionta cind apare sputa infectata si se modifica aspectul radiologic cu agravarea hipoxiei. Semnele sint foarte putin sensibile.
Cele trei situatii clinice (ALI/ARDS, VAP, VILI) induc modificari metabolice locale specifice. Este de asteptat ca identificarea unora dintre metaboliti sa permita diagnosticarea lor precoce a acestor situatii clinice. Tentativele care au fost facute in domeniul bio-markerilor in acest sens, nu au avut succes.
Avind in vedere multitudinea de molecule care se pot identifica in singele circulant o serie de autori s-au orientat catre aerul expirat.

Biomarkerii sistemici
Dintre biomarkerii investigati, singurul util in patologia pulmonara de care ne ocupam este procalcitonina care poate identifica uneori VAP.
Niste consideratii

– Procesul inflamator in cele 3 stari de mai sus este puternic limitat teritorial (compartimentat). Fenomenele mici si medii se manifesta in teritoriul pulmonar si in BAL iar atunci cind apar modificari sistemice, fenomenele sint deja grave.

– Unul sau doi markeri sistemici nu pot prind integra complexitate a proceselor locale care se refera la inflamatie, coagulare, apoptoza.

– Dinamica acestor procese este de asemenea foarte rapida iar determinari unice si/sau intermitente nu pot surprinde complexitatea evenimentelor. Recoltarea frecventa de probe sanguine pune probleme speciale de confort al pacientului, de pierderi de masa sanguina, de manipulare la nivelul sectiei si in afara ei…

Markeri biologici pulmonari

BAL – direct necesita specialist pentru recoltare

– indirect se poate recolta mai usor dar da inforamtii mai putin fiabile
nu se poate face decit supraveghere intermitenta in acest moment
S-a folosit tehnica proteomics pe acest lichid biologic


“-Omics” si biologia sistemelor

Studiul “-omics” reprezinta o imagine integrata a biochimiei intr-un sistem biologic oarecare si are patru domenii: genomis, transcriptomcs, proteinomics, metabolomics. El nu este efectuat plecindu-se de la o ipoteza care trebuie confirmata sau infirmata. Se face un studiu global al moleculelor din categoria respectiva. Biologia sistemelor biologice se concentreaza pe combinarea diferitelor domenii “-omics” si incearca intelgerea in profunzime a acestor sisteme. Combinind informatiile chimice cu metode matematice complexe se urmareste sa se obtina modele ale structurilor si proceselor intrinseci acestor sisteme.
Importanta abordarii fara ipoteza prestabilita a studiului biologiei sistemelor vii este foarte bine ilustrata de hemoglobina glicolizata in controlul glucozei daibeticului. Ea a fost identificata prin cromatografie si ulterior s-a gasit strinsa sa corelatie cu evolutia diabetului zaharat fiind unul dintre cei mai importanti biomarkeri in domeniu. Daca s-ar fi lucrat pe ipoteza apriorica, HbA1c nu ar fi fost niciodata identificata. S-a mers, insa, pe evaluarea globala prin cromatografie a complexului proteinelor la diabetic.

(nn. Toti cei care am lucrat in cercetare ne-am izbit de la inceput de obligatia de a emite o ipoteza de lucru atunci cind, de fapt, doream sa vedem ce se intimpla in cutare sau cutare situatie. Ni s-a explicat ca nimeni nu ne va accepta nici un fel de studiu daca nu vom emite o ipoteza pe care sa o investigam. Exista chiar un intreg aparat metamatic care are ca scop validarea sau invalidarea ipotezei noastre. Orice statistician se oripileaza da ca nu ii dai o ipoteza pe care sa o verifice si iti explica ca nu esti decit un analfabet – a se citi idiot – in ale matematicii, daca nu din toate punctele de vedere.)

Metabolomul este un corp de structuri extrem de complex si dinamic , sensibil la fenomenele fiziologice normale si patologice fiind un rezultat al activitatii combinate a genomului, transcriptomului si proteinomului.
Metodele recente de studiu (NMR = nuclear magnetic resonance , LC-MS = liquid-cromatography/mass -spectromtry) chimic analitic permit identificarea concomitenta a sute de produsi in aceeasi proba biologica. Atentie mare la variatia proceselor, dimensiunea probelor si nevoia de repetare frecventa a determinarilor. (nn. desi problema nu ne privesteprea tare, pe noi ca practicieni, este bine de stiut ca sint pasi foarte precisi care trebuie efectuati petnru a se evita false descoperiri senzationale). Avind in vedere ca matabolismul est un proces vechi si bine conservat pe scara evolutiei rezultatele pot fi transferate usor intre diferitele sepcii de mamifere.
Pina acum putini s-au aplecat asupra studiului metabolic global al pacientului critic. Exista citeva studii:

– SIRS, MOF. Abordarea de tip metabolom poate diferentia clar intre SIRS si MOF si poate face predictii asupra evolutiei pacientului.
– Injuria pulmonara la soarece. Se obtin date care pot face deosebirea intre ALI/ARDS si subiecutl normal. Unii metaboliti pot fi corelati cu scorurile clinice si zilele libere de ventilator. Sudiile s-au facut pe plasma.

Breathomics
(nn As fi putut traduce “respiratomics” dar suna ca naiba iar unul dintre profesori mei in ale cercetarii mi-a spus ca atunci cind apar termini care nu au echivalenta in limba romana este de preferat sa fie consemnati ca atare si nu tradusi. Timpul va horati daca ei vor ajunge altfel in limbajul de specialitate.)

Aerul respirat contine mii de compusi organici volatili (VOCs) care sint metaboliti rezultati atit in procesele fiziologice cit si cele patologice. Identificarea lor prin miros a fost folosita in clinica umana din vechime. Ei pot proveni din procese sistemice (diabet, intoxicatii…) sau local pulmonare. Microorganismele existente in tractul respirator produc si ele compusi volatili care pot fi specifici pentru anumite specii.
In acest scop s-au folosit tehnici ca:

– Specrometrie de masa pe cromatografie gazoasa (GC-MS)
– Ion –mobility spectrometry (I-MS)
– Tehnica nasului electronic

GC-MS
Este considerata standardul de aur in materie de detectare, separare si identificare de produsi chimici volatili.
Ea presupune transportul produsilor volatili cu un transportor inert (heliu) printr-o coloana unde sint separate prin volatilitate. Urmeaza separarea prin spetcroscopia de masa prin principiul raportului masa/incarcatura. Componentele sint ionizate in particule incarcate electric, transportate printr-un cimp magnetic se determina cantitaiv.
Probele de aer expirat trebuie sa fie preconcentrate, stocate si manipulate adecvat. Preconcentrarea permite identificarea unor compusi cu concentratii mici. Stocarea introduce factori de risc de pierdere a unor compusi instabili. Avind in vedere evolutia pacientului critic datele este necesar sa poate fi disponibile in minute de la recoltare. (nn Aviz laboratoarelor particulare care dau rezultate dupa zile sau saptamini de asteptare. Acelasi aviz l-as face directorilor de spitale care privatizeaza laboratoarele de nu mai poti obtine rezultatul de la un frotiu de singe priferic decit in 7 zile. Am patit-o eu de nenumarate ori. Intre timp pacientul fie crapa, fie isi revine fara mareata lor contributie). GC-MS nu poate face asta, totusi, fiind o tehnica care necesita timp.
Schubert et all au investigat cu GC-MS aerul expirat de la pacienti ventilati mecanic. Autorii au gasit reducerea producerii de isopren la pacientii cu ALI si cresterea raportului n-pentan/isopren la pacientii cu VAP. Cresterea concentratiei de isopren este considerata ca marker de activare a neutrofilelor. Redeucerea concentratiei de isopren a fost explicata de autori prin alterarea sintezei de colesterol la pacientii cu stadii avansate de ALI. N-pentanul est un produs final al peroxidarii lipidelor si poate reflecta o crestere a stresului oxidativ. Desi acetona, isoprenul si n-pentanul sint cei mai abundenti produsi in aerul expirat, limitarea numai la citeva molecule nu este in idea de baza a studiilor “-omics”. Este necesar sa se identifice si dozeze toate moleculele volatile identificabile si sa se stabileasca un profil specific.

Ion-mobility spectroscopy
I-MS a fost propusa ca o metoda analitica rapida si senzitiva pentru detectarea moleculelor in faza gazoasa. In aceasta tehnica moleculele volatile se ionizeaza si se directioneaza catre un detector printr-un cimp electric extern. Molelcule ionizate sint trecute intr-un tub unde intra in coliziune cu moleculele unui anume gaz (“drift”gas- gaz de abatere, deviere ) care umple tubul sicircula in tub in sens invers.In functie de forma si dimensiune ionii sint decelerati rezultind diferite intervale de “ion drift” (deviere a ionilor). Introducerea probelor de gaz de examinat in tubul de examinare se face repetat si cu un anumit ritm.
Timpul rapid de reactie, posibilitatea de utilizare la patul bolnavului si inregistrarea continua ii confera acestei tehnici aplicabilitate clinica.
Pentru moment, tehnica nu o poate ilocui pe precedenta, petnru ca inca nu au fost studiate in extenso toate moleculele posibil prezente in aerul expirat.
Dolch et all au utilizat aceasta tehnica identificind si masurind timp de 120 de minute o serie de compusi volatili. Din nefericire nu s-au facut comparatii cu subiecti din grupuri relevante.
O alta modalitate de a analiza cromatogramele I-MS este pattern recognition software. Se merge pe principiul ca nu este nevoie sa se identifice fiecare molecula ci aspectul general al unei probe. Folosita in acest mod, tehnica a facut diferenta calra cu 100% acuratete intre pacienti cu cancer pulmonar si subiecti normali.
Nu au fost publicate studii cu aceasta tehnica la pacientii ventilati mecanic.

Nasul electronic

e Nose este un sistem integrat de captare a unui amestec VOC (volatile organic compouds) folosindu-se o baterie de senzori (de tipuri si principii variate) destinati mai multor molecule. Semnalul tuturoor acestor senzori este analizat folosindu-se un algoritm de tip pattern recognition. Se obtine astfel o varaibila denumita breath-print care este specifica fiecarui pacient. Aceasta amprenta poate fi folosita pentru identificarea statusului pacientului sau pentru urmarirea avolutie sale. Datele sint disponibile in timp real.
Problema folosirii acestui principiu este la nivelul sensibilitatii si fiabilitatii senzorilor.
In aerul respirat se pot identifica metaboliti ai organismului gazda sau ai germenilor patogeni. Axindu-se pe metabolitii germenilor s-au putut identifica diferite tipuri de bacterii ca : Pseusomonas Aeruginosa (l-undecan), Stafilococus Aureus (acetoin), MRSA, Enterococus Fecalis rezistent la vancomicina.
Tehnica a fos folosita in vivo pentru identificarea infectiei in ICU la pacienti ventilati mechanic cu urmatorii germeni : Klebsiella Pneumoniae, Pseudomonas Aeruginoa, Stafilococus Aureus, Acinetobacte Baumanii, Acinetobacter Lwoffi. Probele de aer in aceasta situatie au fost recoltate pe cateter de aspiratie pe ventilati neinvaziva fara sa se foloseasca si GC-MS in asa fel incit moleculele implicate nu au fost identificate.
Exsita studi care au permis identificarea ALI/ARDS de cauza nepulmonara combinind e.nose cu raportul PaO2/FiO2.