AUICEM 2012

Microbiomul intestinal si apararea gazdei in timpul bolii critice
T.J.Schuijt, T.Vna der Poll, W.J.Wiersinga

Introducere
De multi ani s-a emis ipoteza ca tubul digestiv joaca un rol important si nefavorabil in favorizarea inflamatiei sistemice si a infectiilor in ICU. In timpul stresului si agresiunii mucoasa intestinala devine hipoxica, apar leziunile locale, isi pierde functia de bariera si se face posibila translocatia atit a corpilor bacterieni cit si a produsilor acestora. Procesul se crede ca este implicat in declansarea reactiei inflamatorii sistemice necontrolate asociata cu sepsis si MSOF. Datele noi acumulate despre microbiom i-a fortat pe cercetatori sa reevalueze vechea ipoteza a “intestinului ca motor al sepsisului”.
Microbiota intestinal este alcatuita dintr-un numar mare si variat de germeni care au un rol protector important asupra efectorilor imuni atit in sanatate cit si in diversele stari patologice. Totalitea inforamtiei genetice nucleare a acestor germeni a dost denumita “microbiom”
Microbiota intestinal este dominat de trei grupe de germeni (phyla)

– Firmicutes (G +)
– Bactaroides (G -)
– Actinobactaria (G +)

Exsita o mare variatie interindividuala.
Numarul total de germeni este mai mare decit numarul total de celule al organismului.
O microbiota sanatoasa si echilibrata este importanta pentru apararea gazdei fata de germeni patogeni invadatori. Ei intra in copetitie cu acestia pentru nutrienti, spatiu de dezvoltare, spatii de atasare fata de epitelii. In plus, germenii proprii organismului produc niste compusi denumiti bacteriocine care sint toxine destinate inhibarii cresterii altor bacterii.Microbiomul induce producerea de compusi antimicrobieni si mucus la nivelul celulelor intestinale. De asemenea sintetizeaza nutrienti, vitamine si alti metabolite. Un ultimo rol este acela de “priming” pentru clelulele imune efectoare sistemice.
Avindu-se in vedere rolul complex jucat de microbiom in economia organismului, este necesar sa se reevalueze impactul asupra organismului pe care il are antibioterapia ca factor destabiliztor si dereglant al microbiomului propriu organismului. Cu atit mai mult in ICU, unde majoritatea pacientilor primesc si o antibioterapie, uneori agresiva.

Microbiomul intestinal sanatos
Suprafata intestinala totala este de aproximativ 400m

Epiteliul intestinal si bariera mucoasa

– Celule

1.Enterocite
2.Celule enterocromafine
Secreta serotonina.
3.Celulele Paneth
Sint localizate in IS la nivelul criptelor Lieberkuhn.
Contin in citoplasma loc granule mari si lizozomi.
Secreta molecule efectoare ale sistmului imun innascut (defensine), lizozomi, PLA2, alfaTNF
4.Celulele microfold
Transporta bacterii si duc fragmente bacteriene prin bariera intestinala catre placile Payer.In placile Payer exista celule prezentatoare de antigeni (magrofagele si celulele dendritice). Placile Payer fac parte integranta din GALT (gut associated lymphoid tissue) impreuna cu gg mezenterici si limfocitele laminei proprii.
5.Celulele in potir (goblet) care secreta mucus
Toate acestea sint strins unite intre ele prin jonctiunile intercelulare (epithelial tight jonction) care regleaza permeabilitatea mucoasei intestinale si controleaza pasajul macromoleculelor.

– Bariera mucoasa
Este alcatuita din mucus care este produs de enterocite si de celulele in potir. Ea este dispusa la suprafata enterocitelor pe care o protejeaza de germenii patogeni si substante iritante ca enzime, substante chimice, agresiune mecanica.
Bariera mucoasa lipseste la nivelul celulelor microfold
Straturile superficiale de mucus sint populate cu germenii comensuali in timp ce straturile profunde sint in mod normal starile.

Compozitia microbiomului intestinal
Totalitatea germenilor intestinali formeaza “microbiota” intestinala. Totalitatea genomului acestor germeni a fost denumit “microbiom intestinal”.
Numarul total de germeni intestinal variaza intre 10la13 si 10la14 facind parte din 500-100 specii diferite. Predomina bacteriile, dar mai exista si virusi (5,8%) archeaea (o,8%), eucariote (0,5%). Microbiomul contine de cel putin 100 de ori mai multe gene decit genomul uman.
Exsita o mare variatie intre indivizii umani din punctual de vedere al microbiomului. In ciuda acestui fapt, studii recente la nivel mondial au permis sistematizarea microbiomului intestinal uman in citeva grupuri stabile denumite enterotipuri care nu depind de continent sau natiune sau etnie. Ceea ce permite precizrea faptului ca exista numai citeva variante de statusuri simbiotice echilibrate (gazada-microb simbiotic). Enterotipurile mentionate mai sus sint importante atit pentru fiziologia normala a indivizilor cit si pentru susceptibilitatea la infectii si tipul de raspuns imun.
Se anticipeaza ca identificarea enterotipului la diferitii pacienti ne poate da informatii despre cum reactioneaza acestia la diferitele tipuri de dieta si, ceea ce ne priveste pe noi, la administrarea de droguri.

Rrelatia bidirectionala intre sistemul imun si microbimul intestinal.

Abia a inceput sa se descifreze strinsa relatie care exista intre celulele mucoasei intestinale si microbiomul intestinal. Au fost descrise urmatoarele roluri: protectia fata de leziune celulara, optimizarea raspunsului imun al gazdei si rezistenta la colonizarea cu germeni patogeni. Mai mult, bacteriile intestinale sint importante in dezvoltarea imunitatii mucoasei intestinale. La soarecii care au continutul tubului digestive steril nu se dezvolta adecvat placile Payer care au centri germinativi imaturi, pezinta producere redusa de molecule antimicrobiene la nivleul celulelor epiteliale si reducere a producerii de anticorpi.

Secretia de molecule antimicrobiene si competitia pentru nutritie

Membrii microbiota intestinala secreta produsi antimicrobieni si intra in competitie pentru nutrienti si spatiu de dezvoltare cu germneii patogeni. La omul normal secretia de toxine si molecule antimicrobiene ca bactariocinele de care germenii saprofiti intestinali impiedica dezvoltarea germanlor patogeni.
Ex. Bacteriocinele (produse se secretate de G -) care au ca scop inhibarea cresterii unor germeni similari sau asemanatori inhiba si dezvoltarea altor bacterii ca Salmonella, Shigella, Klebsiella, Enterobacte si Esherichia.
O alta tehnica este aceea a competitiei pe substraturile nutritive. De aceea dieta si nutritia sint factori importanti in compozitia microbiota si fucntia sitemului imun.

Competitia pe nutrienti

Strategia este folosita de toti germenii.
Dieta prebiotica foloseste fibre nedigerabile care favorizeaza crestrea si dezvoltarea germenilor ne-patogeni.
Organismul uman obtine de la germenii sai intestinali saprofiti o serie de compusi ca

– enzime pe care el nu le produce cum ar fi cele necesare pentru polizaharidele vegetale de pectide din peretele celular

– anumiti produsi generate numai de bacterii

o SCFAs (short chain FAs)
o Acetat
o Propionat
o Butirat care este sursa energetica pentru entrocite si are rol important in reglarea functiei immune a enterocitelor

Interactiunea dintre MAMPs si PRRs
Cele trei clase de bacterii care formeaza flora intestinala exprima pe suprafata lor structuri moleculare comune denumite MAMPs (microorganism associated moelculare paterns)

– LPZ
– Peptidoglicani
– LAT (acidul lipoteichoic) G +
– Falgelina

Ele sint recunoscute de PRRs (patern recognition receptors)

– TLRs (14 variante)

o TLR4 – LPZ
o TLR2 – LTA (G +)
o TLR5 – flagelina

– NLRs nucleotide ologomerisatin domaine-like receptors

o Nod1 se gasesc pe enterocite
o Nod 2 se gasesc in celule Paneth din IS.
Ele identifica componente celulare ca
o peptidoglicani
o DAP (mesodiamino pimelic acid)
o MDP (muramyl dipetide)
Recunoasterea MAMPs de catre PRRs declanseaza o cascada de semnalizare intracelulara care duce la activarea NF-kB si intiaza respunsul imun antibcterian.
Compozitia microbiota intestinala si expresia PRRs variaza considerabil de-a lungul intestinului.
Celulele epiteliale intestinale (IEC) au exprimati pe ele urmatorii TLR: 1, 2, 3, 4, 5, 9. Expresia acestora creste in timpul infalmatiei.
Receptorii se exprima si au fucntii deferite in fucntie de zonele celulare, stimularea lor avind rezultate diferite.

Ex. Stimularea TLR 9 exprimat pe zona laterobazala a entrocitelor duce la activarea NF-kB prin inhibarea IkBalfa. Stimularea TLR9 exprimat la nivelul zonei apicale a aceluiasi enterocit duce la prevenirea activarii NF-kB prin acumularea de IkBalfa in citoplasma si blocarea activitatii acestuia. Stimularea TLR9 apical confera toleranta inclusive la nvelul altor TLRs.

In concluzie, polarizarea enterocitelor este mecnaismul unic care permite mentinerea homeostazie colonului si regleaza toleranta acestuia, impreuna cu inflamatia.

Ex. TLR 5 este exprimat numai bazolateral unde declanseaza producerea de chemochine (CCL-20 = chemokine ligand-20) si cytokine (IL-8) ca rspuns la stimularea cu flagelina. Soarecii care nu au TLR5 dezvolta colite spontane si au o crestere importanta a numarului de bacterii pe unitatea de volum de continut intestinal. Deficitul de TLR5 este implicat in sindromul metabolic “full bown” caracterizat prin : hiperlipidemie, hipertensiune, rezistenta la insulina, adipozitate crescuta.

MAMPs declanseaza eliberarea de mucina si ingroasa bariera de mucus.

Productia de anticorpi indusa de antigeni prin intermediul microbiomului

La om, cele mai multe Lf B activate se afla in tractul intestinal in asa fel incit acesta este cel mai mare producator de Ac din organism. Bariera intestinala poate fi penetrata de bacterii si fragmente bacteriene (peretele bacterian). Mecanismul implicat consta in primul rind de celulele microcutate (microfold cells) care transfera acesti antigeni catre celulele imune localizate in placile Payer. Celulele dendritice din placile Payer prezinta respctivii antigeni catre celulele T si B fie in placie fie dupa ce migreaza in gg.limfatici mezenterici. Celulele B localizate in lamina propria a placilor Payer secreta anticorpi (IgA, IgM) care sint transportati in lumenul intestinal de catre enterocite. In lumenul intestinal ramin fixat in stratul de mucus.
sIgA recunoaste si leaga germenii patogeni. Din acest motiv ei mai sint denumiti si “IgA naturali”. Infectia cu un anumit germen patogen este uramta de secretia anticorpilor sai specifici prin acest mecanism.

Efectul la distanta al florei microbiene asupra apararii gazdei.

In mod obisnuit produsii bacterieni trec bariera intestinala, ajung in circulatia sistemica si mentin sistemul imun in alerta avind atit efecte proinflamatorii cit si antiinfalamtorii

– Ex. MAMPs (peptidoglicani) ajung la mduva osoasa unde activeaza NLR (Nod 1) si realizeaza aici “activarea constitutionala” (constitutivly primed) a neutrofilelor

– Ex. de alti produsi care ajung in circulatie: SCAFs, Vitamine (K), ATP, butirat
SCAF si butirautl sint absorbiti in circulatia sistemica unde au efect antiinflamator prin inhibarea HDAC (histone deacetylase) si blocarea ulterioara a caii NF-kB.

Microbsmul intestinal in boala critica

– Afectarea homeostaziei intestinale in critically ill

Structura si functia barierei intestinale este perturbata in ICU iar microbiota intestinala este dezechilibrata.
Un studiu pe flora intestinala in ICU a folosit 3 clase de dezechilibru al florei intesinale pe care le-au comparat cu mortalitatea in MODS

a. single patern : 59%
b. depleted patern : 64%
c. diverse patern: 6%

Depletia florei intestinale normale permite popularea intestinului cu flora patogena.

– Afectarea permeabilitatii barierei intestinale

Citokinele proinflamatorii permeabilizeaza “tight joction”. Ca urmare antigenii luminali ajung in submucoasa unde se declanseaza o reactie inflamatorie bogata in cytokine…
Unii dintre patogenii intraluminali cum este E.Coli permeabilizeaza ei insisi “tight jonctiions”.
Cauze care duc la dezechilibrul microbiotei intestinale in ICU

– In starile critice avem de-a face cu apoptoza crescuta a enterocitelor. (Modalitatile de limitare a apoptozei sint urmate de cresterea supravietuirii la modelul murin.)
– Proceduri care au implicat flora intestinala
– Vasopresaoarele prin ischemia mucoasei si modificarea pH luminal
– Antiacidele prin modifacarea pH luminal
– Nutritia enterala inalt procesata si nutritia parenterala altereaza structura microbiota intestinala
– Opioizii se asociaza cu dezvoltarea excesiva a germenilor intestinali
– Antibioterapia prin modificarea constelatiei speciilor

Efectele antibioterapiei pe flora intestinala

Atb reduce numarul de germeni si prin aceasta reduce cantitatea de cytokine pro-inflamatorii in intestin.
Eradicarea unor anumiti germeni dezechilibreaza microbiota intestinala si permite dezvoltarea germenilor patogeni.

– se suprima germenii imortanti in lantul nutritional local al intestinului
– se suprima germeni care folosesc produsii toxici ai altora
– apar germeni care produc infectii nsoscomiale ca enterococul si clostridium in varientele lor rezistente la vancomicina

Decontaminarea selectiva a intestinului (SDD) cu antibiotice nerezorbabile care se adreseaza drojdiilor, G+ si G- este indicata de autori ca utila dar exista retineri al nivel mondial din cauza posibilitatii de selectie de germeni rezistenti.

Dincolo de antibiotice, modularea terapeutica a microbiotei intestinale in ICU

Scop

– Restabilirea florei intestinale echilibrate.
– Prin acest mod se doreste refacerea unui echilibru al raspunsului imun al gazdei.


Modalitati

– reinsamintarea completa de la donor santos

Ex. transferal de fecale pentru infectia severa recurenta cu clostridium

– Refacerea selectiva cu germeni nepatogeni sau numai cu MAMPs

Traditional, socul septic este considerat o supramanifestare a rapunsului prinflamator. Totusi, pacientii mor in depresie imuna severa dupa activarea buclei de contrareglare antiinflamatorie (CARS = compensatory anti-inflammatory response sindrome).
Ina cest context s-a incercat restabilirea microbiota intestinala. Rezultatele sint contradictorii.

Concluzii
1. Microbiota intestinala joaca un rol important in raspunsul imun sistemic al organismului.
2. Absorbitia de nutrienti si componente microbiene din GUT antameaza si sustine raspunsul imun celular sistemic.
3. Intestinul joaca un rol important in SIRS si MODS.
4. Cedarea barierei intestinale duce la aparitia in circulatia sistemica de germeni si toxine bacteriene.
5. Depletia intestinului de germenii florei normale face mucoasa vulnerabila, permite selectia de germeni patogeni virulenti si reduce primingul pozitiv al sistemului imun.
6. Este momentul sa se rigindeasca relatia organismului cu biocenoza intestinala.
7. Manipularea mictobiotei intesinale (in totalitatea ei sau numai pe componente) este o cale de viitor in terapia umana si mai ales in ICU.

Anunțuri